В своем написанном для журнала «Современник» Н. А. Некрасоваклассическом труде «Рефлексы головного мозга» (1866 г.) обосновал рефлекторную природу бессознательной деятельности и привел аргументы в пользу аналогичной природы сознательной, предположив, что в основе всех психических явлений лежат физиологические процессы, которые могут быть изучены объективными методами, и которые определяются взаимодействием клеток, организмов и популяций с внешней (основной биологический закон Рулье-Сеченова) и внутренней средой. Впервые в мире сформулировал учение об анатомическом и молекулярном принципах физиологии, в изложении которого, признавая решающее значение в нормальной физиологии являющегося высшим этапом развития анатомического принципа клеточного принципа Р. Вирхова, подчеркнул значение молекулярного принципа как единственно возможного общего принципа (клинической) патофизиологии, так как, в частности, дифференцировка клеток, формирование органов и тканей, обмен сигналами между органами, тканями, отдельными клетками осуществляются в среде биологических жидкостей, и обычно патологические процессы взаимосвязаны с изменением химического состава этих биологических жидкостей. Отвергнув ранее господствовавшее учение о всеобъемлющей системе тормозящих нервов, доказал ее отсутствие и обосновал теорию передачи сигналов торможения изменением химического состава биологических жидкостей, особенно плазмы крови. Исследовал почечное кровообращение, пищеварение, газообмен в легких, дыхательную функцию крови, открыл роль карбоксигемоглобина в дыхании и в венозной системе. Открыл явления флуоресценции хрусталика, центрального торможения, суммации в нервной системе, «рефлекс Сеченова», установил наличие ритмических биоэлектрических процессов в центральной нервной системе, обосновал значение процессов обмена веществ в осуществлении возбуждения. Впервые в мире локализовал центр торможения в головном мозге (таламический центр торможения, центр Сеченова), обнаружил влияние ретикулярной формации головного мозга на спинномозговые рефлексы.
